Las estrategias emergentes para la cuantificación correcta de la expresión génica en células unipersonales concretas son prometedoras para revelar el alcance, el funcionamiento y los orígenes de la variabilidad entre células. Se han lanzado diferentes estrategias de alto rendimiento para RNA-seq unicelular que fluctúan en protección, sensibilidad y capacidad de multiplexación. Recientemente hemos lanzado Smart-seq para la evaluación del transcriptoma de células individuales, y posteriormente hemos optimizado la táctica para mejorar la sensibilidad, la precisión y la protección de toda la longitud de los transcritos.
| DNA | |
| MBS6507400-005mg | MyBiosource |
| DNA | |
| MBS6507400-5x005mg | MyBiosource |
| 4-Amino Biphenyl DNA (4-AMBP DNA, 4-Aminobiphenyl DNA) | |
| MBS600356-01mL | MyBiosource |
| 4-Amino Biphenyl DNA (4-AMBP DNA, 4-Aminobiphenyl DNA) | |
| MBS600356-5x01mL | MyBiosource |
| T4 DNA Ligase (T4 DNA) Enzyme | |
| abx073011-25g | Abbexa |
Aquí presentamos un protocolo en profundidad para Smart-seq2 que permite la era de ADNc de longitud completa y bibliotecas de secuenciación mediante el uso de reactivos comunes. Todo el protocolo tarda ∼2 d desde la selección de células hasta tener una biblioteca restante preparada para la secuenciación; la secuenciación requeriría un extra de 1 a 3 d dependiendo de la técnica y el secuenciador.
| Protein-Export Protein SecB (SecB) Protein | |||
| Abbexa | |||
| Protein-Export Protein SecB (SecB) Protein | |||
| Abbexa | |||
| Protein-Export Protein SecB (SecB) Protein | |||
| Abbexa | |||
Las limitaciones actuales son la escasez de especificidad de cadena y la falta de detección de ARN no poliadenilado (poliA(-)). ARN. La modificación del genoma empujada por nucleasas de dedos de zinc (ZFN) produce eficiencias de modificación del gen excesivas (>10%) al introducir una rotura de doble cadena recombinante en el gen enfocado. El corte se induce utilizando dos ZFN diseñadas a medida que se heterodimerizan al unirse al ADN para formar una nucleasa catalíticamente activa. Sin embargo, con la estructura actual de ZFN, también pueden formarse homodímeros competentes para la escisión que pueden restringir la seguridad o la eficacia a través de la escisión fuera del objetivo.
| Beta2-Microglobulin ELISA kit ELISA Kit | |||
| LF-EK60047 | |||
| Human IL-17E ELISA Kit ELISA kit | |||
| E22-HC180.48 | |||
| Human IL-17E ELISA Kit ELISA kit | |||
| E22-HC180.96 | |||
Aquí desarrollamos una estructura ZFN mejorada que elimina este inconveniente. Utilizando un diseño basado en la estructura, diseñamos dos variantes de ZFN que cortan eficazmente el ADN únicamente cuando se emparejan como heterodímero. Estos ZFNs modifican un locus endógeno local con la misma eficacia que la estructura parental, pero con una reducción de >40 veces en el funcionamiento del homodímero y con rangos mucho menores de escisión en todo el genoma. Esta estructura ofrece un medio común para mejorar la especificidad de los ZFN como reactivos de modificación génica.
| Paraffin Wax | |||
| Toronto Research Chemicals | |||
| Paraffin Wax Trimmer | |||
| IHC World | |||
| Paraffin wax pellets | |||
| EWC Diagnostics | |||
| Paraffin wax pellets | |||
| EWC Diagnostics | |||
| Paraffin wax Pellets | |||
| EWC Diagnostics | |||
Enzimas hipertermofílicas: fuentes, usos y mecanismos moleculares de termoestabilidad.
Las enzimas sintetizadas por hipertermófilos (microorganismos y arqueas con temperaturas óptimas de evolución de>> 80 grados C), también denominadas enzimas hipertermófilas, son a veces termoestables (es decir, inmunes a la inactivación irreversible a temperaturas excesivas) y están óptimamente activas a temperaturas excesivas.
| MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit | |||
| Bioingentech | |||
| MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit | |||
| Bioingentech | |||
| PCR-EZ D-PCR MASTER MIX | |||
| Bio Basic | |||
| PCR water | |||
| EURx | |||
| PCR water | |||
| EURx | |||
Estas enzimas comparten los mismos mecanismos catalíticos que sus homólogas mesófilas. Cuando se clonan y expresan en huéspedes mesófilos, las enzimas hipertermófilas suelen conservar sus propiedades térmicas, lo que indica que estas propiedades están codificadas genéticamente. Las alineaciones de secuencias, las comparaciones de material con contenido de aminoácidos, las comparaciones de construcción de cristales y los experimentos de mutagénesis señalan que las enzimas hipertermófilas son, ciertamente, similares a sus homólogas mesófilas.
| Beta2-Microglobulin ELISA kit ELISA Kit | |||
| Abfrontier | |||
| Human IL-17E ELISA Kit ELISA kit | |||
| EnoGene | |||
| Human IL-17E ELISA Kit ELISA kit | |||
| EnoGene | |||
| Rat Cholesterol ELISA ELISA | |
| E01A11128 | BlueGene |
| Rat Cholesterol ELISA ELISA | |
| E02C0745-48wellsplate | BlueGene |
| Rat Cholesterol ELISA ELISA | |
| E02C0745-96wellsplate | BlueGene |
| Goat Cholesterol ELISA ELISA | |
| E01A46041 | BlueGene |
| Goat Cholesterol ELISA ELISA | |
| E06C0745-48wellsplate | BlueGene |
Ningún mecanismo único es responsable de la excepcional estabilidad de las enzimas hipertermofílicas. El aumento de la termoestabilidad debe descubrirse, como alternativa, en una pequeña variedad de alteraciones extremadamente particulares que no suelen obedecer a ninguna pauta aparente de los visitantes. Después de discutir brevemente la gama de organismos hipertermofílicos, esta evaluación se concentra en la termoestabilidad excepcional de sus enzimas.
Se describen las propiedades bioquímicas y moleculares de las enzimas hipertermofílicas. Se revisan los mecanismos responsables de la inactivación de las proteínas. Se mencionan los mecanismos moleculares implicados en la termoestabilización de las proteínas, junto con los pares de iones, los enlaces de hidrógeno, las interacciones hidrofóbicas, los puentes de disulfuro, el empaquetamiento, la disminución de la entropía del despliegue y las interacciones intersubunidad. Por último, se describen los usos actuales y las funciones potenciales de las enzimas termófilas e hipertermófilas como reactivos de análisis y como catalizadores de procesos industriales.
| Rat Cholesterol ELISA ELISA | |
| E01A11128 | BlueGene |
| Rat Cholesterol ELISA ELISA | |
| E02C0745-48wellsplate | BlueGene |
La importación de proteínas nucleares en células de mamífero permeabilizadas requiere componentes citoplasmáticos solubles.
Hemos desarrollado un sistema in vitro con células vertebradas permeabilizadas con digitonina para revisar las ocasiones bioquímicas dentro del transporte de macromoléculas a través de la envoltura nuclear. Mientras que la terapia de células cultivadas con digitonina permeabiliza las membranas plasmáticas a las macromoléculas, las envolturas nucleares permanecen estructuralmente intactas y los núcleos retienen el poder de mover y acumular proteínas que contienen la secuencia de localización nuclear del antígeno T gigante SV40.
El transporte requiere la adición de citosol exógeno a las células permeabilizadas, lo que indica que la(s) cuestión(es) citoplasmática(s) soluble(s) necesaria(s) para la importación nuclear se pone(n) en marcha a lo largo del tratamiento con digitonina. En este sistema de importación reconstituido, una proteína que contiene una señal de localización nuclear se acumula rápidamente en los núcleos, donde alcanza un enfoque de 30 veces en comparación con el medio circundante en 30 minutos. La importación nuclear es particular para una secuencia de localización nuclear determinada, requiere ATP y citosol, y depende de la temperatura.
| Porcelain Buchner Funnel 200 ml, each | |
| -LPC-146 | IHC World |
| 10 mm Diameter Solid Titanium Tip | |
| 0-120-0009 | Biologics |
| 13 mm Diameter Tapped Titanium Tip | |
| 0-120-0010 | Biologics |
| 13 mm Diameter Solid Titanium Tip | |
| 0-120-0011 | Biologics |
| 19 mm Diameter Tapped Titanium Tip | |
| 0-120-0012 | Biologics |
Además, la acumulación del sustrato de transporte en el interior de los núcleos está totalmente inhibida por la aglutinina de germen de trigo, que se une a los complejos de poro nuclear e inhibe el transporte in vivo. En conjunto, estos resultados apuntan a que el sistema de células permeabilizadas reproduce la importación genuina de proteínas nucleares. En una disección bioquímica preliminar del sistema, observamos que el reactivo sulfhidrilo alquilante N-etilmaleimida inactiva cada cuestión(es) citosólica(s) y además parte(s) dentro de la fracción celular permeabilizada insoluble requerida para la importación de proteínas nucleares.
Debido a que este maniquí de células permeabilizadas es sencillo, respetuoso con el medio ambiente, y funciona con éxito con células y fracciones de citosol preparadas a partir de una amplia gama de fuentes de vertebrados completamente diferentes, puede resultar muy eficaz para investigar la vía bioquímica del transporte nuclear.
| Porcelain Buchner Funnel 200 ml, each | |
| -LPC-146 | IHC World |
| 10 mm Diameter Solid Titanium Tip | |
| 0-120-0009 | Biologics |
| 13 mm Diameter Tapped Titanium Tip | |
| 0-120-0010 | Biologics |
| 13 mm Diameter Solid Titanium Tip | |
| 0-120-0011 | Biologics |
Secuenciación polónica multiplex precisa de un genoma bacteriano desarrollado.
Describimos una experiencia de secuenciación de ADN en la que un microscopio de epifluorescencia generalmente disponible y barato se transforma en una automatización rápida de secuenciación no electroforética de ADN. Aplicamos esta experiencia para resecuenciar una presión desarrollada de Escherichia coli a menos de un error por millón de bases consensuadas.
Una biblioteca mate-pareada y libre de células ofrecía moléculas únicas de ADN que se han amplificado en paralelo a microesferas de 1 micrómetro mediante la respuesta en cadena de la polimerasa en emulsión. Millones de microesferas se han inmovilizado en un gel de poliacrilamida y se han sometido a ciclos automatizados de secuenciación por ligadura e imagen en cuatro colores. El coste por base ha sido aproximadamente la novena parte del de la secuenciación estándar. Nuestros protocolos se han llevado a cabo con instrumentación y reactivos disponibles en el mercado.
Fuentes :
| Porcelain Buchner Funnel 200 ml, each | |||
| IHC World | |||
| 10 mm Diameter Solid Titanium Tip | |||
| Biologics | |||
| 13 mm Diameter Tapped Titanium Tip | |||
| Biologics | |||
| 13 mm Diameter Solid Titanium Tip | |||
| Biologics | |||